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PCR儀反應時dNTP和Mg2+充當的角色

發布時間: 2021-12-23  點擊次數: 2953次
   PCR儀采用熒光定量檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、肝炎病毒、流感病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。
  PCR儀的反應過程中dNTP和Mg2+充當的什么樣的角色呢?
  脫氧核苷酸是DNA的基本組成元件,為DNA合成所必需。PCR中使用脫氧核苷酸通常是4種脫氧核苷酸的等摩爾混合物,即dATP(腺嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸)、dGTP(鳥嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸)、dCTP(胞嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸)和dTTP(胸腺嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸),通常統稱為dNTP。
  PCR擴增效率和dNTP的質量與濃度有密切關系,dNTP干粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度,以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液為宜,pH調節到7.0-7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP的濃度應為50-200μmol/L,尤其注意4種dNTP的濃度要相等(等物質的量配制),如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低),就會增加錯配概率。dNTP濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。
  反應體系中游離Mg2+的濃度對PCR反應中耐熱DNA聚合酶的活性、PCR擴增的特異性和PCR產物量有顯著的影響。反應體系中Mg2+濃度低時,會降低Taq DNA聚合酶的催化活性,得不到足夠的PCR反應產物;過高時,非特異性擴增增強。此外,Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產物的解鏈溫度、產物的特異性、引物二聚體的生成等。在標準的PCR反應中,Mg2+的適宜濃度為1.5-2.0mmol/L。值得注意的是,由于PCR反應體系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基團均可與Mg2+結合從而降低游離Mg2+的實際濃度,因此,Mg2+的總量應比dNTP的濃度高0.2-2.5mmol/L。如果可能的話,制備DNA模板時盡量不要引入大劑量的螯合劑(即EDTA)或負離子,因為它們會影響Mg2+的濃度。
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